“中山舰事件”发生之前，周恩来在黄埔军校和国民革命军第一军的地位非同一般，由他执掌的政治部和教练部、教育部并称为黄埔“三大支柱”，并担任第一军副党代表兼政治部主任。
　　
　　但是，周恩来视党的利益高于一切，党性、原则性非常之强，绝不轻易拿其做交易。东征期间，蒋介石曾专门询问过中共在黄埔的情形，希望交出中共党员名单。当时，蒋介石正处于上升发展趋势，又是顶头上司，但周恩来的态度仍然不卑不亢，丝毫没有半点犹豫和回旋：
　　
　　“此事关系两党，须请示中央才能决定。”
　　
　　碰了钉子的蒋介石一脸悻悻然，把此事狠狠地记在了心里，同时也领教了共产党人威武不能屈、富贵不能淫的高风亮节。“中山舰事件”发生后，蒋介石便趁机对周恩来采取了一连串的打击行动和防范措施。
　　
　　事件发生第二天，周恩来从包惠僧那里得知了消息，当即赶到蒋介石的临时指挥所——造币厂去询问详情。到了那里，作为一名高级军官，他却受到了极其粗暴的待遇，带去的四个卫兵都被缴了械，他本人遭到软禁。蒋介石信口雌黄，一口咬定中山舰事件乃是一起针对他个人的“阴谋”。
　　
　　在不明真相的情况下，周恩来保持了克制，但强烈要求蒋介石释放所有被监禁的共产党员。他十分坚定地保证，不管“中山舰事件”真相如何，但有一点可以肯定，那就是与中共无关。

　　
　　形势愈来愈复杂，蒋介石向中共提出了十分苛刻的要求，所有共产党员要退出第一军：不退出的要交出名单。
　　
　　“蒋介石欺人太甚！”中共广东区委负责人陈延年脸色十分严峻地说，他坚决主张对蒋介石展开有力反击。
　　
　　周恩来非常支持陈延年的建议，他认为要对蒋介石的反动行为保持高度警惕，不能掉以轻心，目前的情况是，国民革命军六个军中，只有第一军是由蒋介石亲自指挥的。而在第一军的三个师中，有两个师的党代表是共产党员，九个团的党代表，中共占了七位。另外，还有金佛庄、郭俊两名共产党员任团长职务，直接拥有军队指挥权；营以下各级军官和部队中的共产党员也不少，且都是军中骨干力量。至于同情革命的左派势力就更大了。更何况第一军又是以黄埔教导团为基干扩编而成的，只要态度坚决，反击得当，是完全可以与蒋介石一较雌雄的。
　　
　　然而，周恩来等人的正确建议，最终遭到了陈独秀的否定。在当时右倾路线占上风的中央领导班子的影响下，采取了妥协退让的政策，失去了与蒋介石武装抗衡的有利时机。就这样，250余名公开暴露身份的共产党员被迫退出第一军和黄埔军校，周恩来也被免去第一军副党代表和政治部主任的职务。陈延年因为这件事，气得大骂他的父亲陈独秀是“老糊涂”。毛泽东则一针见血地指出，“重要之点不在此，在于蒋介石从此更加趾高气扬，在于国民党右派会加强活动，对我们挑衅。”而身处风口浪尖、矛盾旋涡中的周恩来，却充分展示了他后来一贯的人格魅力，一方面忍辱负重，坚决执行中央决议，一方面力尽所能地将损失减少到最低限度。根据他的指示，第一军中的共产党员，凡身份未曾暴露者，仍然秘密留下来，以便日后形势有所转机，继续发挥作用。